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明星產(chǎn)品

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RIPA裂解液(中強度)
產(chǎn)品貨號:RR0801
產(chǎn)品品牌:AboRo
產(chǎn)品分類:分子生物學試劑
產(chǎn)品規(guī)格:100ml
產(chǎn)品價格:199

產(chǎn)品介紹

RIPA 即Radio Immunoprecipitation Assay,是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液。AboRo的RIPA 裂解液裂解所得的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western 等實驗。主要成分是:50mMTris(pH 7.6),150mM NaCl,1% TritonX-100,0.5% sodiumdeoxycholate,0.1% SDS 等多種裂解劑和抑制劑,能有效地抑制蛋白降解。

使用方法

1. 取適當量的NCM RIPA Buffer 裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF 的最終濃度為1mM。

注意:NCM RIPA Buffer 不含蛋白酶等抑制劑,根據(jù)需要在使用前添加蛋白酶,磷酸酶等抑制劑。

2. 樣品前處理

(a)對于貼壁細胞:去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾,可以不洗)。按照6 孔板每孔加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2 秒后,細胞就會被裂解,然后轉(zhuǎn)移至離心管中。

(b)對于懸浮細胞:離心收集細胞,用手指把細胞用力彈散。按照6 孔板每孔細胞加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多,必需分裝成50-100 萬細胞/管,然后再裂解。

(c)對于組織樣品:把組織剪切成細小的碎片,按照每20mg 組織加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量) ,用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。

3. 上述樣品轉(zhuǎn)移至冰上,裂解30 分鐘,中間15 分鐘后補加一次終濃度1mM PMSF。充分裂解后,10000-14000g離心3-5 分鐘,取上清,即可進行后續(xù)的PAGE、Western 和免疫沉淀等操作。


注意事項

1.RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA 等的復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗;如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如NFκB、p53 等時,通常不必進行超聲處理,就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

2.為獲得最佳的實驗效果,可適當分裝使用,以盡量避免反復(fù)凍融。

3.PMSF 應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)加,需自備PMSF,或者可以蛋白酶抑制劑混合物。

4.裂解蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進行。

5.蛋白酶抑制劑均有較高的毒性,為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。4℃保存,室溫運輸,一年有效。

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